綠色熒光蛋白是一類存在于腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。GFP具有多種優(yōu)點:易于檢測,靈敏度高;熒光性質(zhì)穩(wěn)定,耐受性強;易于表達,無細胞毒性;可用于活細胞檢測。
因此,GFP可作為報告基因用于檢測基因表達或調(diào)控,或作為融合標簽來檢測蛋白質(zhì)分子的定位、遷移、構(gòu)象變化以及分子間的相互作用,或者靶向標記某些細胞器。
GFP吸收的光譜最大峰值為395nm(紫外),并有一個峰值為470nm的副吸收峰(藍光);發(fā)射光譜最大峰值為509nm(綠光),并帶有峰值為540nm的側(cè)峰(Shouder)。
雖然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于該激發(fā)光對細胞的傷害更小,因此通常多使用該波段光源(多為488nm)。
此外,GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相似,兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩(wěn)定,在激發(fā)光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素強,特別是在450~490nm藍光波長下更穩(wěn)定。
類似的,GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標記的熒光抗體高,抗光漂白能力強,因此更適用于定量測定與分析。
由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物,因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白,其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比的。
但因為GFP不是酶,熒光信號沒有酶學放大效果,因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白,比如螢火蟲熒光素酶等。
觀察GFP熒光蛋白方法有:
采用熒光蛋白觀測燈是便捷、方便的觀察方法,因GFP在470nm有一個很高的吸收峰,采用 470nm激發(fā)光源能夠激發(fā)GFP發(fā)出明亮的綠色熒光,在觀察gfp熒光時,因為激發(fā)光為強烈的藍色光線,必須佩戴專業(yè)的觀察眼鏡才能觀察到清晰的熒光信號。
2. 紫外光源:
采用紫外光源(又叫紫外線燈、黑光燈)觀察也非常方便,但如果觀察植物,植物葉片的葉綠色在紫外線燈下也會發(fā)出熒光,對gfp發(fā)出的熒光也會產(chǎn)生干擾,另外,標本長時間在紫外光源照射下對GFP標本組織也會造成破壞。
3.熒光顯微鏡
熒光顯微鏡(Fluorescence microscope) : 熒光顯微鏡是以紫外線為光源, 用以照射被檢物體,使之發(fā)出熒光,然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。
熒光顯微鏡用于研究細胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運輸、化學物質(zhì)的分布及定位等。 細胞中有些物質(zhì),如葉綠素等,受紫外線照射后可發(fā)熒光;
另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光,但如果用熒光染料或熒光抗體染色后,經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光,熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進行定性和定量研究的工具之一。
目前在常用的方法就是采用熒光顯微鏡觀察,熒光顯微鏡在實驗室非常普及,但不足是必須采集葉片或動物切片進行觀察,對培養(yǎng)的標本進行破壞,無法進行活體觀察。